采用HER2抗体标记组织中HER2分子，采用EnVision法进行检测，这是 以多聚葡萄糖分子为骨架，HRP标记羊抗兔/鼠IgG，不含生物素和亲和素。显色背景低。

1. 样本处理：

o 石蜡切片（乳腺癌组织，厚度4-5μm）

o 二甲苯（脱蜡）

o 乙醇梯度（100%、95%、75%）

o 抗原修复液（0.01M，CBS修复液，pH 6.0 或者0.05M EDTA修复液，pH 8.0 高压修复或微波修复）

2. 免疫组化试剂：

o HER2单克隆抗体（如CB11，CST公司）

o Envision试剂盒（GK500705，Dako 公司）

o 3,3’-二氨基联苯胺（DAB显色剂）

o 苏木素复染液

o 中性树胶（封片）

3. 辅助试剂：

o 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）

o 封闭液（含BSA或山羊血清）

1. 标本准备

o 石蜡切片厚度4-5μm

o 烤片：56度烤箱2小时或85度烤箱20分钟

o 二甲苯脱蜡：石蜡切片（厚4μm）依次放入二甲苯中脱蜡10min×3次，

o 梯度乙醇脱水：95%酒精中水化2min×2次，流水中冲洗2min

o 抗原修复：微波或高压锅修复（Tris-EDTA pH9.0，10分钟）。

2. 免疫组化染色

o 阻断内源性过氧化物酶 先配置3%H₂O₂（在量筒内加入50ml甲醇和1ml过氧化氢）。把配置好的液体倒入洗片缸，转移切片至切片缸内，加盖移入37℃温箱内，孵育30min。

o 清洗：取出洗片缸，用清水清洗切片内多余的甲醇和过氧化氢，3-4次。

o 抗原修复：修复缸内加入200ml柠檬酸缓冲液（CBS，0.01M，pH6.0），切片放入缓冲液。微波炉900W加热2min30sec烧开，150W持续加热10min，取出后室温冷却30min。

o 血清封闭：切片用0.01mol/L PBS快速清洗2次。用吸水纸擦去切片周围的液体，保留组织湿润，并转移切片到湿盒中，缓慢滴加封闭液，即1:20的羊血清，37℃孵育10min。

o 第一抗体孵育：倾去封闭血清，置湿盒中，滴加第一抗体，兔单克隆抗体HER2（1:100稀释）100ml/片。37℃孵育60min，转移到4℃冰箱，过夜。

o 第二抗体孵育：切片从4℃冰箱取出，用0.01mol/L PBS清洗2min×3次。切片置湿盒中，滴加第二抗体HRP标记的羊抗兔IgG（原液，货号K5007，鼠兔通用）100μL/片，37℃45min

3．显色及封片

显色：切片用0.01mol/L PBS清洗2min×3次。置湿盒中，滴加DAB显色液（1:50稀释, 货号K5007），在显微镜下控制显色时间，取得最佳显色效果后蒸馏水冲洗，终止反应。

o 衬染：切片上滴加苏木素染色液，3min。1%盐酸酒精分化3～5sec，蒸馏水冲洗，饱和碳酸锂1～2min返蓝。自来水冲洗至无色。

o 封片：切片烤干或100%酒精脱水，二甲苯略洗，中性树胶 (上海标本模型厂) 封片。

[操作注意点]

· 抗原修复需严格控温，避免过度修复或者修复不足导致染色效果不佳。

· 显色时间需精确控制（通常3-5分钟），避免假阳性。

· 设立阴性对照（PBS代替一抗）和阳性对照（已知HER2阳性切片）。

[实验结果判读标准（参考CLIA指南）]：

· 0分：无膜染色或弱点状染色（≤10%肿瘤细胞）。

· 1+：弱至中度膜染色（≤10%肿瘤细胞）。

· 2+：弱至中度完整膜染色（>10%肿瘤细胞）。

· 3+：强完整膜染色（>10%肿瘤细胞）。

· 判读结论：3+，2+需FISH验证；0/1+为阴性。