本实验主要介绍三种常用的组织透明化方法，包括CLARITY、CUBIC及PEGASOS。具体如下：

lCLARITY法是利用水凝胶结合蛋白质N-端的特性将含有氨基的生物大分子原位固定，如DNA、RNA和蛋白质等；再借助电场装置及十二烷基硫酸钠溶液去除复合物样品中不透明的脂质成分；最后通过FocusClear或80%甘油溶液等进行折射率匹配；从而形成兼具光学及分子穿透性的组织凝胶复合物。

lCUBIC法在尿素水化作用的基础上，引人使磷脂溶剂化的偏碱性醇胺类物质，从而有效通过将尿素、TritonX-100、醇胺类物质对组织进行处理，快速有效地使组织达到较好的透明程度。由于脑组织的高散射主要来自脂质成分，此方法将生物组织样本放入Scale CUBIC- 1溶液中进行处理，以去除组织样本中的脂类成分。并在Scale CUBIC- 2溶液中加入蔗糖，提高OCA的RI，同时应用该试剂，将其灌注小鼠体内可完整地透明成年小鼠。目前，CUBIC法多适用于含有转基因荧光蛋白的组织样品的透明化处理及组织成像，选择合适抗体可以进行一轮免疫染色技术。

lPEGASOS法是由一个基于聚乙二醇溶剂相关的有机溶剂透明化的技术,这种技术可以使生物组织有更高的透明度,同时保持组织的长期内源性荧光信号。应用于多种生物组织，发现除了色素含量较高的上皮组织外，PEGASOS透明法几乎可以应用于所有类型的组织，包括骨骼和牙齿。

基于自然保护与环境生态学科特点和教学体系要求，拟通过对大量已有环境数据的3D建模和VR仿真设计，以长三角区域水环境生态安全为例建构环境教学虚拟场景, 使学生从不同的方向和角度来亲身感受到认识复杂的地质地貌、水文、水资源、水环境、水安全、气象气候、土壤、植被、灾害等环境数据的空间关系和物理关系,深化对它们内在关系和内部机理的理论研究。

以“虚”补实、应用VR技术和多媒体技术获得实体环境无法达到的教学效果；建成实验实训与沉浸性服务平台与场景，基于互联网形成信息化管理平台，在交叉学科融合发展与互联网+的大背景下，为环境科学与工程类师生提供一个综合性的教、学、考、练的教学项目，为学校提供生态环境科学虚拟实验资源共享和软件教学资源共享。

lCLARITY法

1）动物麻醉及灌注取材

腹腔注射麻醉剂使实验动物处于深度麻醉状态后，依次用预冷的PBS和水凝胶溶液对实验动物进行心脏灌注处理，灌注结束后取待处理组织浸入足量的水凝胶溶液中4℃条件，孵育保存2~3d。

2）脱气与交联

氧气存在会影响水凝胶聚合，因此在聚合前需确保将组织中的残存氧气替换掉，即对组织做脱气处理。将脱气处理后的组织浸入水凝胶溶液中，于37℃孵育3h至水凝胶完全聚合呈凝固状态。

3）组织透明

聚合完毕后取出组织剥去多余的水凝胶，将组织放入清洗液中，置于37℃恒温摇床上孵育直至组织完全透明；在组织清洗时，前3d时以每天1~2次频率换液，后续可适当降低换液频次。

4）透明组织免疫荧光染色

（1）PBST溶液清洗

将透明状态的组织转入0.1% PBST或含0.1% Triton X-100的1mol/L硼酸溶液(pH 8.5)中，37℃清洗3次，每次24h，洗去组织中的SDS成分(若组织来自带有特定荧光信号的转基因小鼠，孵育操作过程中注意避光)。

（2） 一抗孵育

根据组织大小和厚度确定合适的抗体浓度(一般用于CLARITY的抗体浓度是普通组织切片浓度的3~5倍)。用0.1% PBST溶液稀释一抗，37℃孵育2~7d(具体孵育时间视组织大小而定)。

（3） 组织清洗

一抗孵育结束后将组织转入0.01% PBST溶液中，37℃下清洗1~3d(具体孵育时间视组织大小而定)，每天换液2次。

（4） 二抗孵育

二抗的稀释浓度一般为1∶（50～100），37℃孵育2~7d(具体孵育时间视组织大小而定)。

（5） 组织清洗与保存

二抗染色结束后，用0.01% PBST溶液清洗组织1~3d(具体孵育时间视组织大小而定)，注意避光。清洗结束后，可以立即对组织进行成像或置于PBST溶液中4℃保存1周。

5）透明组织成像

（1） 折射系数校正

将组织置于RIMS、FocusClear或87%甘油中校正组织折射系数。

lCUBIC法

将组织浸入4%多聚甲醛溶液中后固定24h。将后固定的组织依次放入1/2 ScaleCUBIC-1溶液中，37℃35rpm处理3~12h；ScaleCUBIC-1溶液中，37℃35rpm处理33~144h；PBS溶液中4℃35rpm清洗12h；1/2 ScaleCUBIC-2溶液中30℃35rpm处理12h；ScaleCUBIC-2溶液中37℃35rpm处理12~72h，至组织呈透明状态。

lPEGASOS法

1） 后固定

将组织浸入4%多聚甲醛溶液中进行后固定，后固定时间依据组织不同略有不同。一般硬组织（如骨骼等）在室温下后固定12h即可，软组织须后固定24h。

2） 组织脱钙 此步骤为硬组织的透明化处理的必备步骤，软组织的透明化处理可省略该处理过程。将硬组织样品置于0.5mol/L EDTA溶液中，37℃100rpm振荡处理2~4d，每日更换EDTA溶液1次。组织脱钙时间取决于骨骼的大小，成年小鼠股骨或下颌骨通常4d可完全脱钙。

3） 脱色

将组织器官浸入25%乙二胺溶液中，37℃100rpm振荡处理1~2d，每日更换溶液1次。若组织未灌注或颜色较深，可将其浸入3％铵溶液中振荡处理6h，使组织充分脱色。

4） 脱脂与脱水

将样品浸入梯度tB溶液中脱脂处理1~2d, tB-PEG溶液中脱水处理2d，37℃100rpm振荡处理。

5） 透明

将样品浸入BB-PEG溶液中，37℃100rpm振荡处理直至组织呈现澄清透明状态。

本项目的考核分为两项：过程考核和结果考核。

（一）过程考核指系统对学生使用者的每个实验步骤进行记录，在学生完成实验后，对学生的每个实验操作进行考核。由于本系统涉及上百个操作步骤（包含重复步骤），限于篇幅所限，以水质监测采样评价（包括“任务1河流水质常规指标监测采样”、“任务2降雨对河流污染影响研究采样”等9个平行的实习任务）的过程考核为例，可窥豹一斑，介绍其过程考核打分标准如下：

考核系统提示：制定完备合理的计划是一次采样实习成功的基础和关键，所以本考核系统分为计划合理性得分和采样规范性得分两部分。

1. 计划合理性得分（满分50分，可得负分）

•采集批次数只设置1次的，扣5分。教师自动评语：采样1次有机会获得的数据不具备普遍性，建议2次以上。

•采样批次日期间隔不足1周以上的，扣2分。教师自动评语：不足1周水质有可能变化不大，无法掌握整个月份的水质变化情况。

•不同批次采样小时信息不一致的，扣5分。教师自动评语：一般多次采样都是不同日期的同一时间段采样，否则不同时间段的采样结果有机会不同。

•采样时间不是白天的，扣5分（任务4必须有夜晚采样时间，如果没有提示严重失误，扣10分）。教师自动评语：夜晚采样有安全风险，研究目的要求晚上采样除外。

•采样时间正好赶上下雨和狂风的，扣2分（任务2必须选择下雨的时间采样，否则扣10分），教师自动评语：下雨采样有风险。如果任务2没选下雨采样，则提示没有考虑下雨天采样与研究目的不符合，是严重的计划失误。

•采样设备对应不一致的扣5分，正确的对应关系如下：任务1、2、3、4、5使用采水器；任务6使用铁铲等，任务7使用携带拖网，任务8使用黑白瓶，任务9使用抓斗。任务5和6一般不用船只。FFA固定剂和甲醛不需要同时使用。如果学生选的不对，则系统根据任务不同提示对应的设备选择错误。

•水样存储设备个数小于采样点数量2倍的扣10分，教师自动评语：严重的计划失误；等于采样点个数2倍的扣2分，教师自动评语：一般要多准备几个存储设备；大于采样点数4倍以上的，扣2分，教师自动评语：存储器带太多，浪费研究经费。

•任务3、任务4和任务8采集深度过浅（表层水）扣2分；任务1、任务5、任务7采集深度过深（非表层水）的扣2分。教师自动评语：采集深度要与研究目的相符。

•采样点只有一个的，扣5分，教师自动评语：一个点有可能无法掌握整条河流的情况；采样点不平均分布的（此处通过空间计算），扣5分，教师自动评语：采样点分布不平均。采样点多于10个的扣2分，教师自动评语：这条河流全长只有20公里，设置多于10个的采样点工作量有可能太大，浪费经费而且一天未必可以完成。

•采样点不在河流上的或者采样点的河流深度小于采样深度的，扣5分，教师自动评语：计划时采样点应选择在河流上，提示此处采样点深度设置过深或者此处采样点不适合研究目的。

•采样预算：车费/天低于100扣2分，教师自动评语：可能预算偏低；车费/天大于600，扣2分，教师自动评语：预算可能偏高，造成经费浪费。船费/天和食宿/天等同上。

2. 采样规范性得分（满分50分，可得负分）

•未携带救生衣道具，扣10分，教师自动评语：未携带救生设备，安全隐患。

•未到采样点附近就采样的，扣10分/未正确的采样点，教师自动评语：编号X采样点与计划偏离。

•未使用GPS记录坐标信息的，扣10分/未正确的采样点，教师自动评语：编号X采样点空间坐标信息缺失。

•未在绳子上做标记的或者标记位置与采集计划的深度不符的，扣10分，教师自动评语：水深信息缺失（任务9不需要此项判分）。

•交互采样操作“小游戏”中，没到绳子标记处附近就上提的，扣10分/未正确的采样点，教师自动评语：上提采水器要到绳子的标记处，编号X采样点水深信息不正确。

•未过滤的，扣2分/未正确的采样点，教师自动评语：杂质可能会污染样本。

•未加固定剂或甲醛的，扣2分/未正确的采样点，教师自动评语：水样未加入甲醛或固定剂。

•未拧储水器盖子的，扣5分/未正确的采样点，教师自动评语：水样可能会洒出，一天的努力会付诸东流。

•每个采集点采不足2次的（指交互采样操作“小游戏”不足2次），扣5分/未正确的采样点，教师自动评语：每个采样点需要采集2次以上。

•时间到达计划的最后一天仍未完成采样并提交任务的，扣50分/未完成的采样点。教师自动评语：未按时完成采样任务。

3. 总分和结果：两者相加，并给出每项得分和扣分理由。全班分数排列之后，按照正态分布打出标准分（满分100分，绝对得分、标准分和每条教师评语都会在系统显示）。同时结果会给出自动提示：为教学操作可行性，评分标准只能做唯一性设计，若学生认为评分不当之处可向任课老师提出质疑，言明当时制定计划和操作的理由，若言之有物，不仅不扣分，还可额外获得加分。

（二）结果考核指学生完成实验后提交实验报告，考核达到基本模型应用的能力、独立进行计算与结果分析、VR场景再现的能力等。

报告文字流畅通顺，逻辑性强，学科术语准确，作业中至少包含10个知识点和20个实验步骤，正确的考察和模拟仿真结果、输入参数与输出结果对应、评价结果与历史作业中的其他学生的结果达到50%以上的对应，则可认为学生达到实验教学的基本要求，基本能够掌握该实验中的知识点，可获得基础分50-60分；

报告中的考察和模拟结果正确，输入参数组合多样，且有相应的实际情景对应，同时具备原因分析；能够给出自己的评估方案，评价结果与历史作业中的其他学生的结果达到75%以上的对应，则可认为学生对水环境生态评估具有较深入的思考，具有解决实际问题的能力，可获得15-25分的加分；

报告中的模拟结果正确，且能指出虚拟仿真实验平台给出的现有各种模型的优劣，并在报告中提出改进方法，并切实可行，则可认为学生具有较高的创新能力，可获得10-15分的加分；

满分为100分，各分数段可客观反映学生的创新性、理解力和实际动手能力。老师对学生的评分和学生之间互评分将作为学生考核的最终结果。