血小板的聚集是机体的重要生理功能，对于维持血液凝固与纤溶系统稳定具有重要意义。其功能异常与出血性疾病及血栓性疾病密切相关。然而由于种种原因，开展血小板聚集实验非常困难，导致本科教学极少有院校开展相关实验。具体原因包括：费用高，需要购买血小板聚集仪，动物及其它耗材销号也很多；操作难，以大鼠为例，腹主动脉採血对于本科生来讲难度大，成功率低；技术难度大，这一点也是最为重要的原因。血小板非常灵敏，对PH值、压力、振荡、保存时间等都很敏感，因此此实验是一个高精密度的操作。
基于上述原因，线下开展血小板聚集实验的难度较大。我们检索了相关虚拟平台，也未见与此相关的内容。然而此实验方法，不仅对药学学生掌握相关药物药理作用很重要，对于医学生同样重要，因此亟需建设相关虚拟仿真实验，为广大医学、药学相关人员提供学习工具。故本项目拟以阿司匹林为例，学习药物影响血小板聚集的实验方法。
本学院开展的《药学综合实验》课程，其中包括有阿司匹林的合成、纯化、鉴定、药效分析及制剂，其中药效研究以血小板聚集实验为检测药效的模型。经过多年实践，虽然实验成功率不高，但积累了大量线下实验的经验。故我们可以设计并制作出具有先进性及适用性的虚拟实验，据此提高线下实验的成功率及教学效果，并可以推广至全国医药院校，为广大学生提供一个学习评价药物对血小板聚集影响的工具。
实验教学目标（实验后应该达到的知识、能力水平）
1、学习大鼠麻醉的基本方法；
2、学习大鼠腹主动脉採血的方法及注意事项；
3、学习血小板的制备方法，包括富血小板血浆和贫血小板血浆；
4、了解血小板聚集仪的使用和血小板聚集功能的测定方法；
5、以阿司匹林为例，学习药物对血小板聚集的影响。
（1）实验原理(限1000字以内)
1、阿司匹林〔Aspirin,2-（乙酰氧基）苯甲酸，又名乙酰水杨酸〕
药理学特征：
阿司匹林是不可逆COX抑制剂，通过共价修饰作用使COX-1分子中第530位丝氨酸或COX-2分子中的第516位丝氨酸乙酰化，导致COX失活。较低剂量的阿司匹林选择性抑制COX-1。
（1）镇痛作用：主要是通过抑制前列腺素及其他能使痛觉对机械性或化学性刺激敏感的物质（如缓激肽、组胺）的合成，属于外周性镇痛药。但不能排除中枢镇痛的可能性；
（2）消炎作用：确切的机制尚不清楚，可能由于该品作用于炎症组织，通过抑制前列腺素或其他能引起炎性反应的物质（如组胺）的合成而起消炎作用，抑制溶酶体酶的释放及白细胞活力等也可能与其有关；
（3）解热作用：可能通过作用于下视丘体温调节中枢引起外周血管扩张，皮肤血流增加、出汗、使散热增加而起解热作用，此种中枢性作用可能与前列腺素在下视丘的合成受到抑制有关；
（4）抗风湿作用：大剂量用于抗炎抗风湿，也可用于鉴别诊断，是风湿性关节炎及类风湿性关节炎首选药物；
（5）抗血栓：小剂量（75-300mg/d）抑制血小板TXA2生成，抑制血小板聚集和血栓形成，可用于预防血栓形成，治疗缺血性心肌病和心肌梗死等。
2、血小板聚集机制：
血小板相互间粘附的特性称为血小板聚集性。在血液正常循环过程中,血小板为静止状态。当给予生理或病理因子刺激时,血小板被激活并黏附于暴露的内皮下组织。在纤维蛋白原(vWF)存在的情况下,释放反应和花生四烯酸代谢则启动,这一行为发生于被激活的局部或皮下组织形成的凝血酶中。前者分泌的二磷酸腺苷(ADP)和由后者形成的血栓素A2可诱导血小板聚集。此外,血小板膜糖蛋白ⅡB/ⅢA(GPⅡB/ⅢA)受体调节血小板聚集,纤维蛋白原和被激活的GPⅡb/Ⅲa受体结合,与血小板结合形成血栓和骨架,参与生理性止血和病理性血栓形成。
3、阿司匹林抗血小板聚集作用机制
阿司匹林抗血小板的机制主要是通过抑制花生四烯酸AA、环氧化酶COX，从而阻断血栓素A2的合成，发挥抗血小板聚集的作用。目前阿司匹林在临床上应用广泛，尤其是在心血管疾病和脑血管疾病方面作为一线用药，主要是用来防止血栓形成。
4、血小板聚集的检测方法
本实验选择的是光学比浊法，其原理为在特定的连续搅拌条件下，于富含血小板血浆（PRP）中加入诱导剂（如ADP），血小板激发生聚集，PRP浊度变小，光电管将浊度变化转变成电讯号并在记录仪上描记出聚集曲线，由此可计算出血小板聚集的程度和时间。
其它方法还有剪切诱导血小板聚集测定法、散射性粒子检测法、全血电阻抗法、血小板计数法、微量反应板法、流式细胞仪法。
知识点：共5个
【重点】
1.掌握血小板聚集仪，低速离心机的使用方法及注意事项。
2.掌握并体会随机，对照，重复三原则在实验操作中的应用。
3.常见致聚剂诱导血小板聚集的原理。
【难点】
1.掌握腹主动脉采血方法；
2.体会并熟悉影响血小板活性的各种因素。
（2）核心要素仿真设计（对系统或对象的仿真模型体现的客观结构、功能及其运动规律的实验场景进行如实描述，限500字以内）
1）大鼠麻醉固定；
2）真空採血管的特点及使用；
3）大鼠腹主动脉解剖及採血；
4）血小板的分离；
5）血小板聚集仪的使用；
6）建构血小板聚集和解聚的仿真模型；
7）药物对血小板聚集的影响模型。
拍摄实验视频，主要介绍大鼠麻醉、腹主动脉取血以及制备富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆的方法，同时介绍血小板聚集仪的使用和血小板聚集功能的测定方法，并对血小板聚集曲线进行解读。
实验流程主要为：①抗凝取血，②制备PRP和PPP，③PRP的稀释，④测试聚集率，设置开放性的实验方案：
1.阿司匹林在不同的溶剂中溶解，测试浓度的设置？
2.考察不同溶剂助溶，对血小板聚集的影响？
3.考察不同致聚剂诱导下，阿司匹林的有效浓度？
4.以ADP诱导为例，考察阿司匹林抗血小板聚集是否有剂量依赖性？
（1）学生交互性操作步骤，共10步
步骤序号 |
步骤目标要求 |
步骤合理用时 |
目标达成度赋分模型 |
步骤满分 |
成绩类型 |
1 |
麻醉动物 |
1 min |
选择题 |
1 |
操作成绩 实验报告 预习成绩 教师评价报告 |
2 |
抗凝剂的选择 |
1min |
选择题 |
1 |
|
3 |
离心顺序的选择 |
1min |
选择题 |
1 |
|
… |
（2）交互性步骤详细说明
把本实验相关的一些节点设计成需要学生做选择的交互题目。
例如：
1.本实验中，涉及血小板的聚集功能测定，请选择合适的麻醉剂和剂量：
A.10%水合氯醛（3.8 mL/kg）B. 10%水合氯醛（6 mL/kg）C.乌拉坦5%（3.8 mL/kg）B. 10%乌拉坦（6 mL/kg）
2.本实验选择哪种血管取血方法较适合？
A.腹主动脉B.颈总动脉C.耳缘静脉B.尾静脉
3.本实验选择哪种抗凝剂较适合？
A.肝素B.枸橼酸钠C.肝素钠B.枸橼酸
4.根据阿司匹林的作用机制，请选择合适的致聚剂：
A.花生四烯酸AA（5×10-4mol/L）B.二磷酸腺苷ADP（5×10-6mol/L）C.凝血酶THR（750 U/L）
5.请选择合适的实验仪器和器材（多选题）
A. LG-PABER-I半自动凝血分析仪B.高速冷冻离心机
C. ACL-HTP动物恒温系统D.电子天平E.半自动血小板聚集仪
6.制备血小板的顺序是：
A.先PPP再PRP B.先PRP再PPP
C.同时制备PPP和PRP
7.本实验中阿司匹林和ADP的加入顺序正确的是：
A.先加ADP,马上加ASP B.先ASP,马上加ADP
C.先加ADP,孵育5min再加ASP D.先加ASP,孵育5min再加ADP
8.本实验中阿司匹林的溶解度不高，因此需要助溶，请选择合适的助溶剂：
A.乙醇B. DMSO C. Na2CO3 D.枸橼酸钠
9．本实验取血时正确的操作是：
A.取血越快越好B.取血速度应适宜，否则回心血量不足，导致出血不畅
C.取好的血强力混匀D.取出的血轻柔混匀，因为血小板容易被激活
10.判断以下对血浆是否合格，可用于后续检测的是：
A. PPP（较澄清，无血细胞，无血小板）B. PRP（较浑浊，含有血小板，无溶血，无血细胞）
C. PPP（浑浊，有血细胞，无血小板）B. PRP（较浑浊，含有血小板，有溶血，无血细胞）
设置开放性的实验方案：
1.阿司匹林在不同的溶剂中溶解，测试浓度的设置？
2.考察不同溶剂助溶，对血小板聚集的影响？
3.考察不同致聚剂诱导下，阿司匹林的有效浓度？
4.以ADP诱导为例，考察阿司匹林抗血小板聚集是否有剂量依赖性？
Tel：021-51980046
Email：xinhong@fudan.edu.cn
研究方向：免疫及肿瘤药理
个人主页：https://spfdu.fudan.edu.cn/9f/95/c28618a302997/page.htm
电话: (021)65642805
邮箱: fanglei@fudan.edu.cn 
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