汉防己甲素是传统中药防己（防己科千金藤属药用植物粉防己的干燥根）的主要活性成分，现已开发成多种制剂用于治疗风湿痛、关节痛、神经痛等疾病。本实验从植物原材料（汉防己粉）进行提取，经过多种分离手段纯化得到单体化合物，继而利用多种波谱/光谱技术对单体化合物汉防己甲素进行结构鉴定，完整呈现了天然化合物从提取到纯化最后到鉴定的全过程。计划虚拟仿真植物原材料的获取，溶剂回流提取，液-液萃取，重结晶，柱色谱和薄层色谱的操作，重点增加化合物的图谱解析，官能团的归属。极大的完善了课程的完整性，增加了课程的趣味性，丰富了学生的课程体验。
实验教学目标（实验后应该达到的知识、能力水平）
1.掌握生物碱类化合物的提取、分离、纯化及结构鉴定手段；
2.重点掌握溶剂回流提取法，液-液萃取法，重结晶法，柱色谱和薄层色谱法操作；
3.掌握天然化合物的紫外、红外、旋光测定基本操作及特征官能团的归属；
4.重点掌握质谱及核磁共振谱（氢谱及碳谱）在生物碱类化合物结构鉴定中的应用。
（1）实验原理(限1000字以内)
利用有机溶剂（甲醇或乙醇）回流加热提取，以免溶剂挥发损失，达到高效提取植物总浸膏。使用真空泵连接盛有液体的容器，使液体表面上的压力降低，在较低压力下进行蒸馏，确保有机溶剂高效回收，被提纯物质不破坏。利用生物碱多具有碱性的特征，调节pH值使生物碱游离析出。利用生物碱在水相和有机相的分配比不同，使用氯仿萃取进一步纯化总生物碱。由于待分离生物碱易于结晶，使用丙酮作为单一溶剂重结晶得到晶体。柱色谱和薄层色谱均是利用吸附剂硅胶对混合物中各成分吸附能力的差别，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续不断地发生吸附—解吸附（洗脱）—再吸附—再解吸附（再洗脱），从而达到混合物中各成分相分离的目的。采用生物碱典型沉淀显色反应结合多种波谱/光谱技术高效鉴定化合物结构。
知识点：共8个
1.总生物碱的提取方法：醇类溶剂热回流
2．减压蒸馏及旋转蒸发仪的使用
3．萃取
4.生物碱与酸成盐，加碱游离
5.重结晶：单一溶剂重结晶
6.柱色谱和薄层色谱
7.旋光，红外，紫外仪器操作及特征官能团归属
8.质谱，核磁谱图（氢谱，碳谱）解析
（2）核心要素仿真设计（对系统或对象的仿真模型体现的客观结构、功能及其运动规律的实验场景进行如实描述，限500字以内）
1.总生物碱的提取：主要涉及的是汉防己根茎的采摘，溶剂回流装置的搭建，减压抽滤基本操作，旋转蒸发仪的使用（已建设）。
2.总生物碱的纯化：主要涉及的是生物碱盐酸盐的制备，萃取，重结晶，柱色谱和薄层色谱基本操作。
3.结构鉴定：主要涉及的是红外分光光度计（已建设），紫外分光光度计，旋光仪的基本操作，红外光谱特征官能团的归属，紫外光谱最大吸收度计算，旋光度的计算。质谱中分子离子峰的确定，主要质核比片段确定；核磁谱图氢谱和碳谱主要结构片段的归属。
1.总生物碱的提取：取汉防己粗粉200 g，加入95%乙醇，水浴回流数次，浓缩得到乙醇提取物，加入400 mL 1%盐酸，抽滤得到总生物碱盐酸盐。
2.汉防己甲素的纯化：氨水碱化总生物碱盐酸盐，加入500 mL氯仿萃取得到亲脂性生物碱，分次使用1% NaOH，水洗涤氯仿层，浓缩得到氯仿提取物，加入丙酮待结晶。加入适量丙酮进行重结晶（此处为开放性实验，需要同学们自行设计完成实验）。取50 mg重结晶晶体，采用硅胶柱色谱，氯仿：甲醇20:1为洗脱剂洗脱，薄层色谱检识得到汉防己甲素纯品。
3.汉防己甲素的结构鉴定：取适量汉防己甲素纯品进行红外，紫外，旋光的测定，核磁谱图（氢谱，碳谱），质谱绘制。
4.汉防己甲素的结构归属：归属红外光谱特征官能团，计算紫外光谱最大吸收度，和旋光度。确定质谱中分子离子峰，主要质荷比的片段，归属核磁谱图氢谱和碳谱主要结构片段。
步骤序号 |
步骤目标要求 |
步骤合理用时 |
目标达成度赋分模型 |
步骤满分 |
成绩类型 |
1 |
乙醇提取液的制备 |
20 |
操作得分 |
6 |
£Ö操作成绩 £实验报告 £预习成绩 £教师评价报告 |
2 |
乙醇提取液的浓缩 |
10 |
操作得分 |
5 |
|
3 |
生物碱盐酸盐的制备 |
10 |
操作得分 |
6 |
|
4 |
氯仿萃取 |
10 |
操作得分 |
6 |
|
5 |
洗涤，浓缩氯仿层 |
10 |
操作得分 |
6 |
|
6 |
重结晶 |
20 |
操作得分 |
10 |
|
7 |
柱色谱洗脱条件的确认 |
20 |
操作得分 |
6 |
|
8 |
硅胶柱色谱 |
30 |
操作得分 |
10 |
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9 |
汉防己甲素红外光谱的测定及主要官能团的归属 |
30 |
操作及归属得分 |
10 |
|
10 |
汉防己甲素紫外光谱的测定及主要官能团的归属 |
30 |
操作及归属得分 |
10 |
|
11 |
汉防己甲素旋光的测定及旋光度的计算 |
30 |
操作及归属得分 |
10 |
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12 |
汉防己甲素质谱的归属 |
10 |
归属得分 |
5 |
3-6步骤要求（不少于10步的学生交互性操作步骤。操作步骤应反映实质性实验交互，系统加载之类的步骤不计入在内） （1）学生交互性操作步骤，共13步
（2）交互性步骤详细说明 1、乙醇提取液的制备：采摘汉防己根茎，干燥，粉碎得到汉防己粗粉，称取200 g粗粉，置于2000 mL圆底烧瓶内，加入95%乙醇900 mL，搭建热回流装置，水浴回流2h，减压抽滤得到乙醇提取液。加入95%乙醇600 mL同法回流2次，每次1h，减压抽滤得到所有乙醇提取液。 问题1：热回流装置中冷凝管水管的连接是上进下出（X） 解析：为了保证冷凝效果，水管的连接应该是下进上出。 问题2：请选择正确的减压抽滤装置（） 2、乙醇提取液的浓缩：将所有乙醇提取液分次倒入圆底烧瓶中，接通旋转蒸发仪减压蒸去乙醇，称重乙醇浸膏。（可借鉴以有虚拟仿真实验《旋转蒸发仪的使用》） 问题3：请选择正确倒入烧瓶中待旋蒸液体的量不应超过：（C） A：1/3 B:1/2 C:2/3 解析：试剂过多容易造成液体爆沸喷溅，污染旋转蒸发仪其他部件。如若需旋蒸的样品浓度较大或者含水量较大可适当降低倒入的量 问题4：请选择正确的旋转蒸发结束后关闭仪器开关的顺序：（A） A先停止旋转后打开真空阀门B:先打开真空阀门后停止旋转 解析：如若在未停止旋转就打开阀门，真空度下降，烧瓶脱落 3、生物碱盐酸盐的制备：在乙醇浸膏中，加入400 mL 1%盐酸，待沉淀完全，减压抽滤得到总生物碱盐酸盐（水相）。 问题5：请选择正确1% HCl的配置方法（B） A：取20%HCl 10mL用水稀释至400mL B：取20%HCl 20 mL用水稀释至400 mL 4、氯仿萃取：氨水碱化总生物碱盐酸盐，测pH值9-10，加入500 mL氯仿萃取得到亲脂性生物碱。 问题6：关于分液漏斗使用，请选择出正确的（D） A：检漏只检查下端活塞B：氯仿层在上层 C:可直接打开活塞放出下层液体，无需打开上口活塞 D:下层液体放出后，从上口倒出上层液体 解析：分液漏斗要保证上下活塞均不发生漏液。密度大的液体（氯仿）在下层。 5、洗涤，浓缩氯仿层：分次使用1% NaOH，水洗涤氯仿层，浓缩得到氯仿提取物，称重，加入丙酮待结晶。 问题7：1% NaOH洗涤的目的是什么（） 解析：洗去亲脂性生物碱中的酚性生物碱 6、重结晶：此处为开放性实验，需要同学们自行设计完成实验。加入适量的丙酮，观察结晶粗品溶解情况，选择合适的过滤装置进行热过滤，待结晶析出完全，选择合适的过滤装置进行冷过滤得到精制结晶。 问题8：重结晶的正确步骤: 热溶解—热过滤—析晶—冷过滤—干燥 7、柱色谱洗脱条件的确认：从石油醚，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，甲醇，5种溶剂系统中两两配置展开剂，利用薄层色谱摸索合适的洗脱剂条件，计算汉防己甲素的Rf值，最终确定氯仿：甲醇= 20:1为柱色谱洗脱条件（Rf = 0.3） 问题9:请选择错误的溶剂配置：（A） A：石油醚：甲醇B：石油醚：乙酸乙酯C：氯仿：甲醇D:氯仿：丙酮 解析：石油醚，甲醇不互溶 8、硅胶柱色谱：采用8 g 200-300目硅胶湿法装柱，取50 mg重结晶晶体，加适量氯仿溶解，湿法上样，氯仿：甲醇20:1为洗脱剂洗脱，收集流份，薄层色谱氯仿：甲醇10:1检识相同斑点的组分合并，旋蒸至干，称重，得到汉防己甲素纯品。 问题10：展开剂为什么选择氯仿/甲醇=10:1, 20:1，2个比例 解析：氯仿：甲醇=10:1，汉防己甲素Rf = 0.5适用于检识化合物纯度以及柱色谱分离情况,氯仿：甲醇=20:1汉防己甲素Rf = 0.3适用于柱色谱洗脱。 9、汉防己甲素红外光谱的测定及主要官能团的归属：采用液膜法，用氯仿将适量汉防己甲素粉末溶解，均匀涂布在KBr窗片上。使用美国赛默飞世尔is5红外分光光度计测定。（可借鉴以有虚拟仿真实验《药学类红外光谱仪的使用》） 10.汉防己甲素紫外光谱的测定及主要官能团的归属：将汉防己甲素配置成1mg/100ml氯仿溶液，使用日本日立2900U紫外分光光度计测定汉防己甲素紫外光谱。 11.汉防己甲素质谱中分子离子峰和主要质核比的片段的确认 12.汉防己甲素的核磁谱图氢谱和碳谱主要结构片段归属。 |
在虚拟实验中，可得到乙醇提取物12-18g，氯仿提取物5-7 g，重结晶得到1g精制结晶。取50mg结晶柱色谱可得到40mg汉防己甲素纯品。
结构鉴定：汉防己甲素为白色针状结晶（丙酮中结出），熔点150 ~152°C /217~218°C。UV(CH2Cl2)谱图中在230，280 nm处有吸收峰，说明汉防己甲素中有苯环结构。IR谱图中在1605，1462cm-1出的吸收峰也证明汉防己甲素中有苯环存在。ESI-MS图谱中给出[M + H]+.峰为623，高分辨质谱给出分子式：[C38H43N2O6]+.，计算不饱和度为18，说明汉防己甲素有可能是双苄基异喹啉生物碱。结合化合物1的1H-NMR（400 MHz, CDCl3）数据：δppm: 3.76 (1H, d,J= 10.3 Hz, H-1), 2.34 (3H, s, NCH3), 2.92 (1H, m, Ha-3), 3.48 (1H, m, Hb-3), 2.45 (1H, m, Ha-4), 2.90 (1H, m, Hb-4), 6.30 (1H, s, H-5), 3.76 (3H, s, 6-OCH3), 3.19 (3H, s, 7-OCH3), 2.48 (1H, dd,J= 14.4, 1.8 Hz, Ha-α), 2.67 (1H, dd,J= 14.4, 10.2 Hz, Hb-α), 6.52 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-10), 3.91 (3H, s, 1-OCH3), 6.81 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-13), 6.86 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-14), 3.87 (1H, d,J= 11.4, 6.0 Hz, H-1′), 2.64 (3H, s, N′-CH3), 2.83 (1H, m, Ha-3′), 3.41 (1H, m, Hb-3′), 2.69 (1H, m, Ha-4′), 2.91 (1H, m, Hb-4′), 6.52 (1H, s, H-5′), 3.41 (3H, s, 6′-OCH3), 6.00 (1H, s, H-8′), 2.77 (1H, dd,J= 11.4, 12.6 Hz, Ha-α), 3.22 (1H, dd,J= 12.6, 6.0 Hz, Hb-α′), 6.27 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-10′), 6.77 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-11′), 7.13 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-13′), 7.34 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-14′)。13C-NMR（150 MHz, CDCl3）数据：δppm: 61.5 (C-1), 44.2 (C-3), 22.1 (C-4), 127.9 (C-4a), 105.7 (C-5), 151.4 (C-6), 137.9 (C-7), 148.5 (C-8), 122.9 (C-8a), 41.9 (C-R), 134.9 (C-9), 116.2 (C-10), 149.4 (C-11), 147.1 (C-12), 111.5 (C-13), 122.9 (C-14), 63.9 (C-1’), 45.3 (C-3’), 25.2 (C-4’), 127.9 (C-4a’), 112.7 (C-5’), 148.6 (C-6’), 143.8 (C-7’), 120.2 (C-8’), 128.1 (C-8a’), 38.3 (C-R’), 135.2 (C-9’), 132.7 (C-10’), 122.0 (C-11’), 153.7 (C-12’), 122.0 (C-13’), 130.2 (C-14’); 42.3 (NMe-2), 42.6 (NMe-2’), 55.8 (OMe-6), 55.9 (OMe-6’), 56.2 (OMe-12), 60.3 (OMe-7)。
Tel：021-51980171
Email：jxiong@fudan.edu.cn
研究方向：天然药物化学，新颖结构活性天然产物的发现、生物功能及化学生物学研究
个人主页：https://spfdu.fudan.edu.cn/9f/62/c28615a302946/page.htm
电话: (021)65642805
邮箱: fanglei@fudan.edu.cn 
地址:上海市杨浦区邯郸路220号
