（1）实验原理(限1000字以内)

蛋白和多肽是两性电解质，当溶液的PH值处于该蛋白的等电点时，蛋白质分子游离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，处于等电状态，此时该蛋白质分子在电场中的迁移率为零。在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度（正极附近是低pH区，负极附近是高pH区）。混合的蛋白样本在此体系中进行电泳时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭窄的区带中，这种电泳技术称为等电聚焦电泳技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。

IEF电泳时使用的两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。

在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分离和鉴定。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进阳离子去污剂（SDS）-SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。同时，SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷。多肽结合SDS的量只与其分子量成正比，而与多肽序列无关，所以SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关。双向凝胶电泳（2-DE）是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。其第一向电泳基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦电泳的方法分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE的方法分离。所以双向电泳可以将复杂蛋白混合物中的分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

双向电泳的第一向等电聚焦电泳现在一般采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，而且此种胶条已有商品生产（比较昂贵！）。等电聚焦仪目前最常用的是商业化的Amersham Pharmacia公司的IPGphor电泳系统。IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)，可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13，18，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

荧光差异双向电泳技术(DIGE)是对双向电泳在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，即在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，采用不同的荧光标记混合后进行双向电泳来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在该技术中，由于每个蛋白点都有它自己的内标，且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证了所检测到的蛋白丰度变化的真实性。

（2）核心要素仿真设计（对系统或对象的仿真模型体现的客观结构、功能及其运动规律的实验场景进行如实描述，限500字以内）

本虚拟实验采用第一人称视角，且界面全部参照实验室原物仿真设计，保证了学生较好的体验感。尤其值得一提的是，所有设备的操作界面是采用完全仿真的设计，例如“等电聚焦电泳仪”的电压和电泳时间的设置，全部采用和仪器相同的接触式按钮设置的方式，可以帮助学生真实模拟大型精密仪器的使用方法。

通过虚拟现实技术，学生也可在实验操作错误时逼真感受到事故的发生，这会给学生们带来深刻的体验以及记忆，让学生对实验安全感同身受！

【实验概述】

荧光差异二向凝胶电泳技术一般分为以下几个步骤：1. 样品制备：样品制备主要包括溶解、变性、还原等步骤，以充分破坏蛋白质之间的相互作用，并同时去除样本中的非蛋白质组分如核酸等。样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：a. 尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；b.减少对蛋白质的人为修饰；c.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。2. 第一向等电聚焦电泳。3.胶条的平衡和转移 4.第二向SDS电泳。4. 凝胶的扫描和分析。

（1）学生交互性操作步骤，共10步

（2）交互性步骤详细说明

1.称重：天平操作！（开电源，将空离心管放上，去皮，然后称重，显示重量)，称重完，右键，放回工具箱；

2.组织块匀浆：右键，拾起； 右键，打开电源；右键，关闭电源； 右键，取出；右键，放回工具箱；右键，整理；

3.细胞悬液制备：离心机， 右键，打开仓门； 点击time，20min;点击speed，12000 g;点击temp, 4℃；用完离心机，右键，放回工具箱。

4.样品BSA法测浓度:

将0.85% NaCl溶液加入到96孔板中后，右键，将0.85% NaCl溶液放回工具箱。

将BSA标准液加入到96孔板中后，右键，将BSA标准液放回工具箱。

将Bradford试剂加入到96孔板中后，右键，将Bradford试剂放回工具箱。

摇床： 将96孔板放在摇床上，右键，打开电源；右键，关闭电源；2min后，放回工具箱。

酶标仪：右键，开启电源；右键，打开仓门；将96孔板放入酶标仪；右键，开始检测；设定Absorbance,595nm; Shaking,设定595nm，Then,点击start.

5.样本的荧光标记：

40ul WT样本，倒推WT样本蛋白浓度为2.5 ug/ul

40ul OB/OB样本，倒推OB/OB样本蛋白浓度为2.5 ug/ul

6.等电聚焦电泳:

先设置参数；点击edit，进入到下一行设置参数；

7.胶条转移

组装模具：右键，拧紧螺丝

Then，右键，拧紧螺丝。（架子会自动移下来）

胶条转移

右键，取出；

8.第二向SDS-PAGE垂直板电泳分离

凝胶配置：16650 ul 30% Acrl Bis溶液.由于SDS是一种强阴离子去垢剂．所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响．而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。

9.利用Typhoon多功能荧光扫描仪扫描

点击“确定”，出现以下界面,右键，取出；

10.比较样品间蛋白质丰度的变化:

来自于所有样品的每个蛋白点都将在内标中显示出来，每个蛋白点的定量分析不是通过Cy3和Cy5标记的两个蛋白样品的直接比较，而是通过被标记的样品与内标进行比较得到标准的丰度，从而比较样品间蛋白质丰度的变化。这样就保证了胶与胶之间蛋白点的精确定量，得到更具统计学意义的试验数据。

荧光差异凝胶电泳技术是蛋白质组学中差异分析的新方法，具有敏感度高，重复性好，宽动力学范围等优势，不仅可对简单如试验组与对照组的试验设计进行分析，也适用于多条件因素的复杂试验设计，并可提供蛋白质的翻译后加工修饰的相关信息。实验的操作版本有含操作提示和不含操作提示两种方式，以适应不同程度的学生的使用需求。如果研究生和高年级学生在使用此软件时，建议他们使用不含操作提示的模式，这样所有的仪器设备、移液器、试剂均需自行根据标准的“实验步骤”来选择和进行，难度较大，但是学生的自主性更强。对于低年级没有实验室经验的学生，则可以打开操作提示，在操作提示的帮助下完成整个实验。