（1）实验原理(限 1000 字以内)

1.  基因编辑技术 CRISPR-Cas9 系统

基因编辑（gene editing）技术是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因 进行修饰的一种基因工程技术。 CRISPR-Cas  系统是目前应用最广泛的基因编辑工具。早期发 现该系统是原核生物的一种天然免疫系统。CRISPR-Cas 系统由 CRISPR  基因座，tracr RNA  基 因和一系列 Cas 蛋白基因组成。目前，应用最为广泛的是Ⅱ型 CRISPR-Cas 系统，即作用因子 是单一的 Cas9 蛋白的系统。CRISPR-Cas9 技术利用 sgRNA（small  guide  RNA）引导 Cas9 蛋白 对特定位点的 DNA 双链进行切割，sgRNA 具有短小、序列可定制、易于制备、成本低等优点， 因此 CRISPR-Cas9 基因编辑技术迅速发展， 并被广泛应用于各种模式生物基因的功能研究中。其应用包括基因敲除、基因敲入、基因抑制、基因激活、多重编辑、功能基因组筛选等等。

2. 显微注射技术及应用

显微注射是一种利用毛细管通过机械方式（气压），将外源的细胞、遗传物质等外源物质 直接注入细胞或组织，然后由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而 使外源基因嵌入宿主的染色体内或直接作用于靶点。显微注射有着广泛的研究和临床应用，包括通过 DNA 注射实现细胞转染、通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）实现受精、将基因工程胚胎干细胞引入囊胚等。

显微注射应用的范围非常广泛， 从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的 转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的 存活细胞中的基本机体生物化学状态，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注）和转基因动物的制作等。显微注射技术的优点在于外源基因没有长度上的限制，且精度很高、效果良好。缺点在 于仪器价格贵、技术练习时间长。本实验的目的是利用显微注射技术与 CRISPR-Cas9 重组编辑后的 sgRNA 质粒，构建果蝇突变体品系。

3. 果蝇的胚胎发育

果蝇的卵、胚胎、幼虫和成体都具有明确的前-后轴和背-腹轴。果蝇形体模式的形成是 沿前-后轴和背-腹轴进行的，在早期胚胎发育当中， 细胞核分裂第十三周期之后细胞膜才形 成。在这之前，所有的分裂细胞核共用一个细胞质， 沿着前-后轴和背-腹轴的细胞类型特化 都是在一个多核细胞当中完成的。同时，由于昆虫卵的大量卵黄集中于卵的中央，大部分细 胞质分布在卵周， 因此卵裂被限制在近卵质膜的细胞质中。这种卵裂的特点就是最初只是卵 黄块中心的核进行分裂， 并不伴有细胞质的分裂。这两点特征为在胚胎发育早期采用显微注射法基因编辑制作果蝇突变体系提供可能。

知识点：共 5  个

1.  果蝇的饲养与繁殖

2.  通过数据库对特定基因进行检索和结构分析

3.  特定基因 sgRNA 的设计与合成

4.  果蝇胚胎的显微注射

5.  果蝇突变体的检测及性状观察分析

（2）核心要素仿真设计 （对系统或对象的仿真模型体现的客观结构、功能及其 运动规律的实验场景进行如实描述，限 500 字以内）

以经典模式生物果蝇为研究对象，模拟仿真不同的实验条件，包括具体的制备步骤和实 验现象， 设置不同的果蝇性状相关基因， 设置不同的检索路径和分析方法；针对不同的基因 组成和结构设置不同的 sgRNA 序列，并针对 sgRNA 的合成过程设置不同的试剂配比和参数，对制备好的 sgRNA 进行特定基因敲除实验的仿真测试；针对显微注射实验设置不同的操作参数， 获得不同批次的被显微注射过的果蝇； 结合仿真的果蝇基因组检测数据进行数据处理， 确定不同 sgRNA 对特定基因的敲除效率，绘制测序结果谱图；对果蝇性状基因敲除前后的性 状特征进行仿真表征，明确 sgRNA 的设计位点及制备方法对敲除效率的影响，并与果蝇突变体的构建成功率进行关联，仿真出 sgRNA 在构建果蝇突变体和研究基因功能中的关系。

实验系统采用全三维建模，模型需包括果蝇培养箱、生物实验操作台、基因扩增仪（PCR  仪）、琼脂糖凝胶制备和电泳装置、微量移液器、高速离心机、显微注射装置、水浴锅等。程 序实验包含实验知识介绍功能、基础知识考核功能、果蝇的繁育功能、特定基因的分析功能、 特定基因 sgRNA 的设计与合成功能、果蝇胚胎的显微注射功能、果蝇突变体的检测功能、果蝇性状基因突变体的仿真功能和实验报告功能。

（1）实验教学过程

教学过程采用线上虚拟仿真与线下讲解相结合的方式进行。

老师向同学们讲授基本知识、原理，讲解仿真实验操作过程及注意事项，并通过LED显示器演示虚拟仿真实验过程。课后学生通过网络进行仿真练习，熟悉整个仿真软件的使用方法及步骤。学生可以通过网络平台进行相应的仿真练习、Flash动画等资源的查看学习。

虚拟课程：经过一段时间的自主学习后，学生通过互动式仿真模拟软件亲自动手进行参数设置、操作、获取实验数据。

评价：线上由老师进行课程管理、资源管理、考核管理等。最后通过实习报告和操作评分系统对每组学生对仿真实验的掌握程度进行打分。

（2）实验方法

与真实实验过程一样，学生可以获取准确、完整的实验数据。通过虚拟仿真教学，使学生深入、快速、直观的理解通过基因编辑技术CRISPR-Ca9系统构建果蝇基因突变体，研究基因功能的过程，调动学习的积极性和学习热情。通过本课程的授课，可以内化学生所学专业知识，提高学生的团队意识和合作意识。仿真的教学既可采用学生个人独立实验方式，又可采用班组合作的方式，可根据教学需求和学生的培养目标灵活调整。这两种参与模式均可达到训练学生独立思考问题、解决问题和动手的能力，其合作模式还可强化学生的团队意识和合作意识。虚拟仿真实验延伸了教学的时间，拓展了教学的空间。本项目通过网络进行远程学习，不受场地、人员、时间的限制，可通过反复学习深刻认识和理解基因和基因型，与

性状和表现型之间的关系，熟悉和掌握CRISPR-Ca9基因编辑技术中特定sgRNA的设计方法以及通过生物体内敲除特定基因，研究基因功能的操作方法与流程，达到综合实验训练的目的和提高学生专业兴趣和理论联系实际的能力。

（2）交互性步骤详细说明

操作共分为三个阶段：知识认知，实验操作及分析，实验报告整理，共13个步骤。

阶段一、知识认知。

本阶段包括步骤1到步骤3，使学生了解实验的背景，熟悉实验中的实验设备并了解操作使用及注意事项等，回顾相关专业知识，为进行实验做好相关准备。

步骤1、观察基因编辑技术的动画原理展示及操作过程。

操作目的：使学生了解基因编辑技术的基本原理，了解对生物体内特定基因进行编辑的

操作过程。

操作过程：学生首先进入虚拟实验室，通过基本知识介绍了解整个实验的操作过程，进入第一步操作，了解基因编辑技术及CRISPR-Cas9系统进行定点基因敲除的基本原理。

操作结果：学生通过动画模拟过程观察了解基因编辑技术CRISPR-Cas9系统敲除特定基因的过程，并观察生物体内基因敲除后的一些性状变化结果。

步骤2、观察果蝇生长发育周期和培养条件

操作目的：使学生了解模式生物果蝇的生长发育周期和培养所需的培养基、温度等环境条件。

操作过程：学生进入虚拟实验室，浏览模拟真实实验室的果蝇培养操作场景，并选择性的通过基本知识介绍完善自己在果蝇发育和培养方面的知识。

操作结果：学生通过展示和动画了解果蝇的发育周期和培养条件。

步骤3、观察显微注射操作系统

操作目的：使学生了解果蝇胚胎显微操作装置各种仪器设备及操作过程。

操作过程：学生进入虚拟显微操作室，通过选择性操作和基本介绍了解每个仪器设备的操作要点及注意事项。

操作结果：学生通过展示和动画了解显微操作装置的规范使用过程。

阶段二、实验操作及分析

本阶段包括步骤4和步骤13，让学生掌握利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建果蝇突变体的操作方法，掌握果蝇的饲养与繁育过程，掌握特定基因的初步生物信息学分析及体外合成基因的方法，掌握动物胚胎显微注射操作技术，具备采用正向遗传学方法研究生物体内基因功能的能力。

步骤4、掌握饲养果蝇的常规操作

操作目的：使学生掌握果蝇的生长发育周期和培养条件。

操作过程：学生进入虚拟果蝇培养操作室，正确选择出果蝇培养器皿、果蝇培养基和设定果蝇培养箱的温度，并在模型图片中指认出是果蝇四个发育阶段的哪个阶段。

操作结果：学生通过选择操作和图形识别能够对果蝇进行饲养，并认识果蝇的发育状态。

步骤5、掌握雌雄果蝇鉴别和交配的操作

操作目的：使学生掌握果蝇的麻醉操作和雌雄的特征。

操作过程：学生先选择果蝇的麻醉方式，然后通过选择开启果蝇的麻醉装置，对果蝇进行麻醉操作，对麻醉好的果蝇进行雌雄鉴别分类，然后1:1交配后放入培养箱中培养。

操作结果：学生通过虚拟麻醉设备对果蝇进行麻醉，并能识别雌雄果蝇，每位学生选择

3对果蝇进行交配繁殖培养。

步骤6、掌握果蝇特定的性状基因结构特征分析方法

操作目的：使学生掌握通过果蝇数据库对果蝇特定性状基因进行检索和结构分析的方法。

操作过程：学生选择合适的果蝇基因分析数据库，选择特定的果蝇性状基因，并对基因的内含子，外显子以及启动子区域进行分析。

操作结果：学生可以对特定的基因进行正确的分析，并指出其结构特征。

步骤7、掌握特定基因sgRNA设计和合成操作

操作目的：使学生掌握特定基因敲除用sgRNA的设计方法及合成操作

操作过程：学生对选定的基因进行敲除区段的选择，然后选择不同的网站，操作设计sgRNA，在虚拟操作实验室完成sgRNA的合成。

操作结果：学生设计好特定基因sgRNA后并合成获得仿真用sgRNA溶液。

步骤8、掌握显微注射用混合液的配制操作

操作目的：使学生掌握显微注射果蝇胚胎混合液的浓度配比

操作过程：学生在虚拟操作室内选择出需要使用的溶液，如Cas9蛋白和sgRNA等，并根据不同溶液的浓度选择合适的配比，并将溶液混合后置于冰水待用。

操作结果：学生将不同的溶液按照浓度配比加好混合。

步骤9、掌握显微注射用果蝇胚胎准备操作

操作目的：使学生掌握显微注射用果蝇胚胎的收取和固定等操作。

操作过程：学生进行虚拟操作室，准备果蝇产卵盘，调整果蝇昼夜节律，使果蝇能在白天产卵；将收集好的果蝇卵清洗干净，并去除卵的坚硬外壳；然后在载玻片上贴上一层双面胶，在体式显微镜下将果蝇胚胎后端朝上成行排列等。

操作结果：学生获得仿真的去除外壳并排列好的有利于注射用的果蝇胚胎。

步骤10、掌握果蝇胚胎显微注射操作

操作目的：使学生掌握显微注射技术，能够操作显微注射装置将Cas9蛋白和sgRNA等混合液注射入果蝇胚胎，并获得果蝇突变体。

操作过程：学生进入虚拟显微操作注射室，操作拉针仪制备毛细管针，用微量加样器给针头装液，然后调节针尖和果蝇胚胎，设定显微注射压力参数，选择合适的角度和力度将注射器内溶液注射入虫卵。注射时要观察虫卵表面有无凸起程度，有无外渗情况，还要检查注射针是否通畅，防止堵塞等。

操作结果：学生获得一批经过注射后的果蝇胚胎，如20-30颗。

步骤11、掌握注射后果蝇胚胎的饲养方法和操作

操作目的：使学生掌握注射后果蝇胚胎的后续饲养操作方法。

操作过程：学生注射完一批果蝇胚胎后，将胚胎置于有湿润滤纸的培养皿中，放入18℃培养箱中培养发育，然后将成功孵化的幼虫挑出，置于含有果蝇饲料的培养管中在25℃下继续培养发育成成蝇。

操作结果：学生获得一批仿真注射后发育完全的果蝇成虫，确保至少3对。

步骤12、掌握果蝇突变体的分子检测方法

操作目的：使学生掌握果蝇突变体的分子检测方法，包括果蝇基因组的提取方法、体外扩增目的基因特定片段的操作方法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的操作方法。

操作过程：学生在虚拟操作实验室将注射后发育完全的果蝇成虫1:1交配，并分开独立培养，取其每一对产卵后孵化的幼虫10条，提取全基因组DNA，并选择合适的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测序，然后对测序结果进行分析。

操作结果：学生获得经过分子验证的果蝇单一性状突变体。

步骤13、掌握果蝇突变体中基因功能检测方法

操作目的：使学生掌握观察果蝇基因功能缺失后的表型性状，并掌握使用一些分子技术手段确定基因功能与表型性状之间的联系。

操作过程：学生通过观察描述果蝇突变体的表型特征，联系与敲除基因之间的关系，并能分析选择后续还有哪些实验技术可以进一步确定该基因功能与该表型性状相关。

操作结果：学生对选定的果蝇性状基因突变后观察到了相应性状的改变，如白眼，小翅，黑体等，由此更深入地理解基因与表型之间的关系。

阶段三、实验报告整理

本阶段包括步骤14，根据虚拟仿真实验的数据，现象，分析结果，整理成实验报告进行提交。

步骤14、撰写实验报告，总结思考。

（1）果蝇的培养、麻醉与雌雄交配繁育

提供不同的培养基，培养箱的温度学生可以通过“+”和“-”进行设置，学生选择正确的培养方案，并温度设置正确后才能进入到下一步。在果蝇气体麻醉操作的过程中，如果果蝇瓶放置的方向不对，如：果蝇瓶瓶口朝上，则会导致果蝇均被气体冲入培养基致死，操作失败，重新麻醉操作。麻醉好后获得雌雄果蝇混合在一起的果蝇照片，然后按类选出三只雌果蝇和三只雄果蝇，这些照片可以放大观看果蝇身体细节，选择正确后才能进入到下一步；通过选用不同的培养基和培养温度，学生可获得不同生长发育速率的果蝇。实验现象及相关的化学反应。

（2）特定基因sgRNA的设计和合成

按照提示选择特定基因sgRNA的设计要求和条件，选择操作错误将无法进入到下一步，每个基因选择设计三条sgRNA，不同的sgRNA注射后产生的果蝇的突变效率将不同。在sgRNA体外转录合成操作过程中，选用不同的参数条件和操作步骤，选择错误无法进入到下一步，有些参数或者操作步骤设置一个最优数据和操作注意事项，如果没有选中，将没法获得最优的实验结果，有警示对话框弹出。

（3）果蝇胚胎的显微注射

按照提示进行显微注射用试剂溶液的选择，并提供不同浓度的样品，根据不同的浓度选择合适的配比完成混合液的配制，如果选择的不是最优配比，将会影响后续实验结果，如果选择操作错误，将无法进入到下一步。注射针与果蝇胚胎的角度需要调整到合适位置，如果位置不对，将无法注射入液体。操作过程中将设置针管堵塞等障碍，学生需排除并解决问题后才能进入下一步操作。

（4）果蝇突变体的检测和功能验证

对果蝇突变体进行检测验证确定好后，对照不同性状基因突变体产生不同的果蝇突变体，并表现出不同的表型，归纳总结影响生物体内基因功能表达的调控机理。