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基于虚拟仿真(VR)环境下,通过网络化人机互动方式,对复杂生物样品中的蛋白质进行酶解、磷酸化富集、HPLC分离和MS分析实验操作,观察实验现象,并分析实验数据;学习高效液相色谱法(HPLC)和质谱(MS)法的基本原理,了解HPLC和MS仪器的基本结构、工作原理及二者的联用技术;深化本科生实验教学内容,学习当前分析化学学科前沿的研究技术,学习科学研究的基本方法,提高学生的科学研究能力和创新能力。

从虚拟仿真实验的角度考虑:

(1)蛋白质纳米材料富集、HPLC分离和MS鉴定技术是当前蛋白质组学研究的强大支撑技术。开设该实验,让学生在掌握基础知识的前提下,可以更好地接触到学科前沿研究工作,提升学生科研创新意识和科研能力。

(2)对蛋白质分离和分析鉴定实验,由于仪器购买和运行成本昂贵,目前还无法满足“能实不虚”的实验条件,无法满足本科生基础课实验教学要求。开设虚拟仿真实验,可生动地展示和理解实验原理、了解实验过程,达到“以虚补实”的作用。

完整蛋白质组学研究实验(包括本实验所涉及的蛋白质酶解、富集、分离和分析实验)所需时间过长,而学生又要受课时、学时的限制。开设虚拟仿真实验,可缩短实验时间,使学生在有限的时间内学到更多的知识,提升教学效果。

(1)蛋白质酶解;

利用胰蛋白酶对蛋白质进行酶解得到分子量较小的肽段。胰蛋白酶会选择地水解蛋白质中所有的由赖氨酸Lys或精氨酸Arg的羧基所构成的肽键,从而生成C端为赖氨酸Lys或精氨酸Arg的肽段,通常长度在几个到几十个氨基酸之间,分子量在500Da到5000Da之间。

(2)纳米材料富集多肽;

基于亲疏水相互作用,利用C18修饰的纳米材料可以选择性的吸附肽段,从而将多肽与强极性的小分子和无机盐进行分离;基于磷酸根基团与TiO2、Ti2+、Zr4+等的配合亲和作用,可以利用TiO2、Ti2+、Zr4+等修饰的纳米材料选择性的吸附磷酸化肽段,从而实现具有磷酸化后修饰的多肽富集。

(3)HPLC分离;

利用反相色谱原理对多肽进行分离,固定相为C18修饰的色谱柱,流动相为A(水相)和B(甲醇、乙腈等有机相)的混合相,基于亲疏水相互作用对多肽进行分离。通常采用梯度洗脱的方法得到较好的肽段分离效果。流动相起始为纯A相,B相浓度逐渐增加到所有多肽均被洗脱。色谱梯度条件的控制对于LC-MS/MS联用鉴定蛋白的效果至关重要。

(4)MS鉴定蛋白质。

利用串联质谱作为LC的检测器,可以对色谱分离的每个馏分中的多肽的精确分子量和特征碎片质量进行测定。利用电喷雾离子化方法,可以生成完成的分子离子,利用飞行时间质谱等高分辨质量分析器可以得到分子的精确分子量(< 20 ppm)。选定特定的母离子质荷比后,可以利用四级杆质量分析器选择母离子,之后利用碰撞碎裂CID等方式诱发多肽的碎裂。CID引起的碎裂通常发生在氨基酸之间的肽键(C-N)上,产生特征的碎片离子。利用飞行时间质谱等高分辨质量分析器可以对碎片的精确分子量进行测定。综合多肽的精确分子量和碎片信息,可以实现多肽的结构分析。通过质谱数据解析,可以实现蛋白质的鉴定和结构分析。

通过虚拟现实技术,模拟了蛋白质酶解及纳米材料富集多肽操作过程,并在构建的虚拟高效液相色谱仪器上,对多肽进行分离。模拟采用梯度洗脱的方法得到较好的肽段分离效果。所建立的虚拟串联质谱,能够精确测定分子量和特征碎片质量,实现多肽的结构分析。通过质谱数据解析,可以实现蛋白质的鉴定和结构分析,从而对实验核心要素的仿真度可以达到98%以上。

知识点:共 4 个

(1)蛋白质酶解;

(2)纳米材料富集多肽;

(3)HPLC分离;

(4)MS鉴定蛋白质。

蛋白质组学的研究是分析化学的研究前沿和热点问题。在过去的二十多年里,复旦大学化学系各位教授热衷于蛋白质组学研究,利用多种蛋白质酶解、富集、分离和分析鉴定技术对影响人类健康的重大疾病如肝癌、胃癌、肠癌等的生物样本进行研究,同时也发展和建立了蛋白质酶解、富集、分离、分析鉴定等新技术。将高水平实验内容、关键技术、特色项目引入到基础化学实验教学中,改变传统实验内容薄弱、远离学科前沿、缺乏学校特色、对学生缺乏吸引的局面,已经成为实验教学改革的热点与共识。

在蛋白质组学研究中,高效液相色谱和质谱联用(HPLC-MS)技术是常用和重要的支撑工具之一。但由于生物质谱仪器价格昂贵、运行成本高,使得该类实验在本科生实验教学中难以大范围展开。

随着虚拟实验技术(VR)的成熟,人们开始认识到虚拟仿真实验在教育领域中的应用价值。VR在实验教学方面具有可视性强、实验时间短、经济实惠、利用率高、易维护等诸多优点。近年来,国内的许多高校都根据自身科研和教学的需求建立了一些虚拟实验室。

本实验的实验教学方法:

本实验拟构建一个HPLC-MS联用技术鉴定蛋白质的虚拟仿真实验平台。利用该平台,学生可以在VR设备上进行虚拟的蛋白质酶解、富集、分离和鉴定实验。实验过程中可以设置不同的实验参数达到改变实验条件的作用,并获得不同的实验结果。通过对实验结果的分析和评价,选择最优化的实验条件,达到最佳的分析结果。实验项目采用翻转课堂实验教学方法,学生通过使用本虚拟仿真实验系统,不受时间空间限制,为多样化的实验教学方式提供了新的思路。通过线下查阅文献,提交文献综述,进行小组讨论实验方案,最终在网上进行虚拟实验操作。学生完成实验后,利用线上、线下混合式的教学平台,教师辅导答疑,实现了虚拟仿真实验教学“翻转课堂”的全新教学模式。将高成本、高难度、高耗时的前沿科研过程常规化,满足本科生参与科学前沿的需求,通过与现有的基础教学实验相结合,能起到相互补充、相互促进的教学效果。

VR教学目的:

(1)不可实验到可以实验:本实验采用模拟实验的教学模式,学生通过虚拟仿真实验,可以实现因仪器价格昂贵和维护使用成本高而现实中无法进行的实验学习和研究。通过该实验,学生可以学习和掌握科学前沿知识和技术,使学生在本科教学实验学习中掌握更多新知识。

(2)不可见到可见:采用模拟实验的教学模式系统可以更好地模拟实验过程,将实验仪器的工作原理可视化地呈现出来,将黑箱化的实验仪器和实验运行过程用三维动画的形式展示出来,更便于学生对方法原理和仪器工作原理的认知和理解。直观的视觉效果,比之现代化仪器的黑箱式学习有更好的教学效果。

(3)不可动到可动:采用模拟实验的教学模式系统这样一种先进的数字化人机接口技术,进入一个由计算机生成的人机交互式三维虚拟现实环境中,与之产生互动、进行交流,可以解决现实实验中不便让学生自行改变的仪器参数而进行的实验条件设计和优化。

(4)不可完成到可以完成:采用模块式虚拟仿真实验系统,学生实验不受时间、空间限制,可以针对自己感兴趣或不理解的问题分别进行模块化学习和系统性学习,灵活性更高。学生可以在短时间、甚至分隔的时间内进行实验,不再受时间和空间条件的限制,在较短的时间内完成一个现实中需长时间才能完成的大实验。

具体实施过程包括

(1)实验前基础理论知识预习:学生实验前必须先行预习该实验相关的基础理论知识,了解实验相关仪器的主要结构、仪器使用方法以及仪器参数选择的原则等。

(2)了解实验目的和熟悉实验内容:实验前学生通过预习熟悉本次实验的实验目的和实验内容,以便在实验过程中知道该如何优化选择实验条件并获得最佳实验结果。

(3)考察预习情况:通过网上测试题的回答,了解学生对实验方法原理、仪器原理以及实验数据解读等相关知识的掌握情况。达到要求标准即可进行虚拟仿真实验,否则要再行实验前学习,以保证实验过程的合理性、有效性以及实验结果可行性。

(4)虚拟仿真实验:学生在实验前掌握相关知识的基础上进行虚拟仿真实验。具体实验过程包括单一或混合蛋白质的酶解、磷酸化多肽富集、多肽HPLC分离和分离多肽的MS鉴定。在实验过程中,①学生可以自主输入改变实验参数、可视化的观看学习相关实验过程的实验原理三维动画视频、获得在该实验条件下的实验结果数据或图谱。根据输入参数的不同,获得相应的实验结果数据或示意图谱(构建输入实验条件变量、仪器基础知识和工作原理可视化展示以及实验结果的示意性输出的组合模式);②虚拟实验为模块式实验。要求学生实验中分别优化酶解、富集、分离和分析模块的实验条件,并根据实验结果评判条件选择的优劣,从而选择出优化的实验条件,以便获得最佳的实验结果(每个模块单独优化模型变量,各模块变量间是分离的关系);③虚拟仿真实验系统可以让不同分组同学选择不同样本进行实验分析,实现样品输入的多种选择和对应结果输出(例如可以建立约5个样品数据,学生实验就可以有5种选择)。

(5)数据分析和蛋白质质谱鉴定数据搜库:对标准蛋白质和混合蛋白质样品体系,学生可以根据所掌握的理论知识和质谱串级谱图数据自行拼接出肽段的氨基酸序列,并根据简单的蛋白质质谱数据库确定鉴定蛋白质的种类。这一内容,对学生而言,是一个知识的学习过程,也是对现行数据库检索蛋白质原理的认知过程;对复杂样品体系的质谱数据分析,可以利用开放数据库进行检索,以确定鉴定蛋白质的种类。这一过程可以帮助学生学会复杂蛋白质样品质谱数据的解读方法,并了解现有的常用蛋白数据库。

(6)提交实验报告:学生根据实验结果,分析实验数据,完成并提交实验报告。

(7)可能的真实实验:在条件成熟后,如能后续获得支持购买液质联用仪器,学生可以进行真实的实验。

(8)延伸学习:学生在学有余力的情况下,可以进行两方面的延伸学习。一是实验相关研究方法的文献阅读和学习,如酶解反应器、纳米材料富集蛋白质和多肽、多维色谱分离分析技术以及蛋白质生物质谱鉴定技术。这些方面我系老师已有很多高水平研究成果;二是对实验鉴定到的重要蛋白质进行文献检索和阅读,了解该蛋白质在生命过程中的作用,进一步了解科学研究在现实社会中的重要意义。

实施效果:

(1)实验过程更直观、更生动、更形象,更易于理解和掌握

由于现代化实验仪器更高级、更自动化、更集成化、更模块化、更黑箱化,学生在真实的实验过程中只能是简单进样(如用注射器进样等)和在计算机上对仪器配套软件点击鼠标的操作。而虚拟仿真实验可以将黑箱化的实验过程以图像动画的形式显示出来,更易于理解和掌握。

(2)可自主选择实验参数,便于学生对理论的理解和仪器实际操作的认识

在使用真实的仪器进行学生教学实验时,由于仪器精密度高、学生没有仪器使用经验,不能让学生随意改变仪器参数;此外,在真实仪器上改变实验仪器参数进行条件选择实验,需要较长的实验时间,所以也不能让学生自主选择参数,只能用老师优化给定的参数。而虚拟仿真实验不存在仪器损坏的风险,仿真实验过程又可以缩短实验时间,因此学生可以根据所学理论知识改变和优化实验仪器参数,以获得更好地实验结果。

(3)提高学生学习的主观能动性、对科学知识的认知力和科学研究能力

虚拟仿真实验可以使实验过程更直观和更形象,学生学起来更有兴趣;实验现象和结果随可变参数选择变化促使学生对实验原理更易理解,将理性认识和感性认识更好地结合起来;模块化的虚拟仿真实验设计可以更灵活地改变实验各环节条件,使学生发挥充分的想象力和探究力,从而培养学生对科学研究的兴趣和科研创新能力。

(4)为后续高年级专业学习和研究生学习奠定基础

学生通过该虚拟仿真实验,加深对高效液相色谱-质谱联用技术鉴定蛋白质的认识、理解和掌握,可以为以后的学习和研究奠定良好的基础。

(1)实验方法描述:

本虚拟仿真实验包括蛋白质酶解并用纳米材料富集磷酸化肽后用LC-MS技术分析鉴定磷酸化蛋白质的过程。选择虚拟实验的模式,学生在网络平台的虚拟环境下完成实验过程并获得实验结果。实验平台为学生提供可以参考的实验条件和步骤。

实验过程包含以下方法:①学生学习过程:实验给定一个简单混合蛋白质体系,经胰蛋白酶酶解后得到混合肽段;用修饰的TiO2的纳米材料富集肽段中的磷酸化肽段;富集后的磷酸化肽段经LC技术分离;用LC-MS/MS联用技术分析鉴定分离获得的磷酸化肽段;根据获得的质谱数据并利用给定数据库解析确定鉴定所得的蛋白质种类以及磷酸化修饰位点。②方法应用研究过程:同上述实验过程,用优化的实验方法对给定复杂生物样品体系进行虚拟实验研究;通过利用开放数据库对实验获得的质谱数据检索,确定一系列磷酸化蛋白质;对鉴定的蛋白质进行文献文献检索和阅读,了解该蛋白质的生物功能。

虚拟实验平台实验过程框图见附件1.

液相色谱串联质谱分析细胞中蛋白质序列实验流程图和部分实验平台图见附件2.

从化学的角度设计的具体实验目的、方法和步骤包括:

1)考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量

该步骤的实验目的:确定样品蛋白质的浓度,以确定后续蛋白质酶解实验应该选择的胰蛋白酶用量。

1-1.吸收曲线的绘制

取两只1.5 mL离心管,根据表1分别加入相应量的标准蛋白溶液、染色液和去离子水,充分混匀。反应一段时间后,用1号溶液作为空白,在450-700 nm波长范围内测定2号溶液的吸收曲线,确定最大吸收波长。

表1吸收曲线溶液的配置

离心管编号

标准蛋白质溶液(μL)

染色液(μL)

去离子水(μL)

1

0

800

200

2

200

800

0

1-2.标准曲线的绘制

取6只1.5 mL离心管,按照表2配制溶液,得浓度分别为0、3、6、12、18、24μg/mL的系列标准溶液。充分混匀,一段时间后,以0号溶液调零,测量1~5号标准溶液在最大吸收波长处的吸光度,记录数据。(注:测量过程需在5~10min内完成)

表2标准曲线溶液的配制

样品编号

0

1

2

3

4

5

染色液(μL)

800

800

800

800

800

800

标准蛋白溶液(μL)

0

10

20

40

60

80

去离子水(μL)

200

190

180

160

140

120

1-3.复杂蛋白质样品中蛋白质含量测定

取2只1.5 mL离心管,分别加入10μL的未知生物样品,按标准曲线的溶液配制方法配制未知样品溶液,在最大吸收波长处测定吸光度。

1-4.蛋白质定量

绘制标准曲线,根据朗伯-比尔定律A=εbc计算蛋白质含量(ug/mL)。

2)蛋白质的胰蛋白酶酶解方法:

该步骤的实验目的:考察酶解条件对酶解产物的影响;将样品蛋白质酶解为肽段,以便后续LC-MS/MS对蛋白质进行分析鉴定。

2-1.混合蛋白溶液的配置和酶解(无需还原烷基化)步骤

分别称取0.5 mg牛beta酪蛋白(β-casein)、2 mg马肌红蛋白(MYO)、2 mg牛血清白蛋白(BSA)于1.5 mL离心管中,加入995 μL 25 mM的碳酸氢铵水溶液(pH=7.9),煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的溶液冷却到室温,按蛋白与胰蛋白酶质量比40:1的量加入胰蛋白酶,于混旋仪中保持37 ℃混旋溶液16小时,即可得混合蛋白的酶解液。

2-2.细胞系样品的胰蛋白酶酶解(还原烷基化)步骤

吸取2 μL细胞裂解样品加入到1.5 mL离心管中,加16 μL 25 mM的碳酸氢铵水溶液(pH=7.9)和2 μL 200 mM的二硫苏糖醇(DTT)水溶液后55 ℃反应1小时(还原蛋白的二硫键),再加入1 μL 500 mM的碘乙酰胺(IAA)水溶液避光反应半小时(以IAA的酰胺基封闭上一步还原反应生成的巯基基团)。将上述溶液用25 mM的碳酸氢铵水溶液(pH=7.9)稀释5倍,按蛋白与胰蛋白酶质量比40:1的量加入胰蛋白酶,置于混旋仪中37 ℃恒温反应16小时。酶解产物真空冷冻冻干后以备富集实验使用。

3)纳米材料富集磷酸化肽段

该步骤的实验目的:富集酶解产物中的磷酸化肽段,以便后续LC-MS/MS对蛋白质进行分析鉴定。

3-1.混合蛋白酶解溶液中磷酸化肽段的分离富集

用上样缓冲液(ACN/H2O/TFA=50/49.9/0.1, v/v/v)配制10 mg·mL-1磁性二氧化钛纳米材料分散液。取1μL混合蛋白的酶解液与10 μL磁性二氧化钛纳米材料分散液和上样缓冲液混合于500μL EP管中,补加上样缓冲液至100 μL。于恒温混旋仪中,37 ℃下振摇30min完成富集磷酸化肽。

富集完成后,用100 μL上样缓冲液分三次洗涤富集了磷酸化肽的材料,再加入10 μL洗脱液(0.4 M氨水)于材料中,在37 ℃下振摇20 min洗脱富集得到的磷酸化肽。将洗脱液冻干以备HPLC-MS分析。(对磁性材料用磁铁分离;非磁性材料用高速离心机分离)。

3-2.细胞系样品酶解产物中磷酸化肽段的分离富集

用上样缓冲液配制10 mg·mL-1磁性二氧化钛纳米材料分散液。加入50 μL磁性二氧化钛纳米材料分散液和50 μL上样缓冲液于冻干的血清酶解样品,混匀后置于恒温混旋仪中于37 ℃振摇30 min完成富集。

对富集后的材料用200 μL上样缓冲液分三次清洗,在清洗后的材料中再加30 μL洗脱液(0.4 M氨水)并在37 ℃下振摇20 min洗脱富集到的磷酸化肽。重复洗脱2次。合并两次的洗脱液,冻干以备HPLC-MS分析。

4)磷酸化多肽HPLC分离分析

该步骤的实验目的:考察色谱流动相分离梯度对分离结果的影响;优化色谱分离条件。

4-1.混合蛋白磷酸化多肽HPLC分离分析

流动相配比为A相:95 %水+5 %乙腈+0.1 %甲酸;B相:95 %乙腈+5 %水+0.1 %甲酸,体积比。

取12 μL A相溶液重溶冻干的洗脱磷酸化多肽,再用nanoLC及在线ESI质谱对重溶液进行分离分析。取10 μL重溶液上样到C18分析柱(75 μm x 25 cm)上,然后进行梯度分离。流动相梯度为t:0-10-90 min,B%:2-2-40。流速为300 nL/min,ESI电压为2.2 kV。Orbitrap Fusion质谱仪在数据依赖采集模式(DDA)下运行。具有正二、三、四价的肽段离子在下述步骤5)依次通过高能碰撞解离(HCD)继续碎裂。

4-2.细胞系样品蛋白磷酸化多肽LC-MS分析

流动相配比为A相:95 %水+5 %乙腈+0.1 %甲酸;B相:95 %乙腈+5 %水+0.1 %甲酸,体积比。

取12 μL A相重溶冻干的洗脱多肽,再用nanoLC及在线ESI串联质谱对重溶液进行分离分析。实验中使用的色谱为EASY-nLC 1000系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA),质谱为Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)。取10 μL重溶液上样到C18分析柱(75 μm x 25 cm)上,然后进行梯度分离。流动相梯度为t:0-10-90 min,B%:2-2-40。流速为300 nL/min,ESI电压为2.2 kV。Orbitrap Fusion质谱仪在数据依赖采集模式(DDA)下运行。具有正二、三、四价的肽段离子在下述步骤5)依次通过高能碰撞解离(HCD)继续碎裂。

注:此处HPLC-MS可以是联用技术,也可以将LC和MS技术分别使用。分别使用这两种技术时,可以分别考察LC(如不同流动相梯度和不同分离时间的影响)和MS/MS(正负离子模式、串级能量等)对实验结果的影响。

数据依赖性采集(DDA)模式的工作原理示意图见附件3.

5)磷酸化多肽HPLC-MS分析鉴定

该步骤的实验目的:考察质谱电喷雾电压对肽谱图的影响;考察MS/MS正负离子电离模式、串级能量等对质谱鉴定结果的影响;HPLC-MS/MS分离富集和鉴定磷酸化多肽并最终鉴定磷酸化蛋白质。

5-1.混合蛋白磷酸化多肽HPLC-MS分析鉴定

利用HPLC和电喷雾质谱(ESI-MS)的联用技术对步骤4)LC分离的多肽进行鉴定。质谱条件同步骤4),ESI电压为2.2 kV。Orbitrap Fusion质谱仪在数据依赖采集模式(DDA)下运行。具有正二、三、四价的肽段离子依次通过高能碰撞解离(HCD)继续碎裂。

5-2.细胞系样品蛋白磷酸化多肽LC-MS分析

同5-1.

搜库原理示意图见附件4.

6)对HPLC-MS鉴定蛋白质的数据分析

该步骤的实验目的:学生学习通过简单混合蛋白质的串级质谱数据在不依赖数据库的情况下分析解读鉴定所得的多肽氨基酸排序,并根据虚拟实验平台提供的简单数据库检索确定相关蛋白质;学习使用蛋白质质谱数据库,学习通过复杂生物样品的质谱数据,利用开放的数据库确定所鉴定到的蛋白质。

6-1.标准蛋白质酶解多肽的质谱数据分析

对标准蛋白酶解多肽的质谱数据进行解析,根据MS/MS数据拼接确定多肽的氨基酸序列和磷酸化修饰位点。在此基础上利用给定的数据库确定鉴定所得的蛋白质种类。

6-2.细胞系提取蛋白酶解多肽的质谱数据分析

对生物样品质谱数据,通过数据库对数据进行搜库,以确定样品中所鉴定到的磷酸化多肽和磷酸化蛋白质。学生学习使用科学研究中所用的开放数据库。

7)文献阅读

在学有余力的情况下,学生可对实验相关方法进行文献检索阅读,拓展知识面;实验结束后对实验鉴定的重要磷酸化蛋白质进行文献检索和阅读,了解其生物功能。

(2)学生交互性操作步骤说明:

1-1.学生随机抽取实验样品

在虚拟实验平台系统下构建2-3种蛋白质的混合溶液以及5-6种细胞在实验体系中的蛋白质裂解液作为学生实验样品。同时在该平台提供可供学生使用的上述实验样品的实验结果的蛋白质鉴定数据和数据库信息。

学生进行实验时可以随机抽取一组样品(包括一种混合标准蛋白质样品和一种细胞裂解样品)用于当次实验。按照提供方法在虚拟环境下分模块进行实验。

学生在实验过程中,可以参考虚拟仿真实验平台给出的实验方法和过程逐个对各实验模块自主选择实验条件(即设定变量参数)进行实验。根据在不同参数下获得的实验结果反馈信息,重新改变新的条件,进行交互性操作。在条件优化完成后,获得最佳实验结果,并在此基础上学习相关实验的方法原理、仪器原理、实验条件优化方法和仪器的使用

1-2.蛋白质酶解实验条件优化

模块一是蛋白质酶解实验。为完成该实验,首先要对选取样品所含蛋白质浓度进行紫外-可见分光光度法定量(该步骤可变参数为:吸收波长的选择显色时间的选择狭缝宽度的选择)。按照定量结果,学生设计合适的蛋白质和胰蛋白酶的比例以及合适的酶解时间进行样品蛋白质的酶解实验(该步骤可设定的变量为:酶的用量酶解温度酶解反应时间)。酶解反应条件的优劣可以通过HPLC-MS实验的结果评判,并由此获得最佳酶解条件。

1-3.纳米材料富集磷酸化多肽条件优化

模块二是磷酸化多肽富集模块。在该模块,用二氧化钛纳米材料富集上述最佳酶解条件下酶解所得到的混合多肽中的磷酸化多肽、分离磷酸化多肽与非磷酸化多肽、并将富集得到的磷酸化肽洗脱(该步骤可设定的变量为:材料用量富集时间富集缓冲液条件、洗脱缓冲液条件),为后续的HPLC-MS实验准备实验对象。磷酸化肽富集结果可以通过HPLC-MS实验的结果评判,并由此获得最佳富集和洗脱条件。

1-4.HPLC分离条件优化

模块三是HPLC分离模块。在该模块,学生将上述富集并洗脱得到的多种磷酸化多肽的混合样品经HPLC分离得到分别单一存在的不同磷酸化多肽(该步骤可设定的变量为:色谱柱选择、色谱流动相洗脱梯度)。色谱条件的选择对混合物的分离程度具有重要作用,而是否能将混合多肽很好地分离,又影响了后续MS以及MS/MS鉴定蛋白质的成功与否。HPLC分离的条件的优劣可以用MS实验的总离子流图的峰分离度及出峰数目评价。

1-5.MS分析鉴定条件优化

模块四是MS分析鉴定模块。在该模块,学生将上述HPLC分离得到的磷酸化多肽通过HPLC-MS联用技术对磷酸化多肽进行质谱分析。根据肽的指纹谱图信号强弱选择一些肽段继续进行MS/MS分析并获得串级谱图(该步骤可设定的变量为:质谱离子化电压鞘气、分析质量范围、质谱分辨率设定、串级质谱的碎裂能量控制、获取质谱数据的正负离子模式)。由串级谱图可以确定鉴定肽段的氨基酸序列,最终确定蛋白质种类。质谱条件的优劣可以通过MS和MS/MS的谱峰结果判断。

1-6.质谱数据搜库及数据分析

对应简单混合蛋白质样品体系,学生根据质谱数据对鉴定多肽的氨基酸顺序自己排序,并提交结果以供虚拟实验平台评判;对应血清或不同细胞蛋白质样品,学生将质谱数据送入开放数据库中,分析鉴定到的蛋白质。

1-7.鉴定蛋白质的生物功能解读

感兴趣的同学可以进行实验相关方法以及鉴定蛋白质的文献检索和阅读。

(1)是否记录每步实验结果:是

(2)实验结果与结论要求:实验报告

(3)其他描述:暂无内容

(1)说明客户端到服务器的带宽要求(需提供测试带宽服务)

经测试,客户端到服务器的贷款要求最低不能低于10M。低于10M过后,网络延迟和丢包现象严重。网页打开非常缓慢,尤其是加载三维实验。所以建议贷款不低于10M.如果是校园千兆网则不存在卡顿问题,加载非常迅速。

(2)说明能够支持的同时在线人数(需提供在线排队提示服务)

实验本身不限制登录人数,可同时在线人数不低于5000,单台服务器分布式部署4个实例每秒可响应最大并发请求数800,超过并发响应数时提供在线排队提示,在先请求处理完毕后处理。

(1)计算机操作系统和版本要求

Windows操作系统,Windows7 64位及以上,Windows8 64位及以上。

(2)其他计算终端操作系统和版本要求

平板电脑要求windows7及以上操作系统。

(3)支持移动端:否

(1)计算机硬件配置要求

推荐配置:

CPU Intel I5 2.0Ghz

内存:4G;

硬盘300G

显卡NV GT700 1G以上

(2)其他计算终端硬件配置要求

服务器推荐配置:

CPU Intel E5 2.0Ghz

内存:16G

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团队成员
樊惠芝|教授博导
负责人

Tel:021-65643982

Email:hzfan@fudan.edu.cn

研究方向:

  • 分析化学;蛋白质组学

个人主页:樊惠芝 (fudan.edu.cn)